Una introducción al proceso de preparación de una muestra biológica para estudiarla microscópicamente
Fijación
La fijación es un método de preservación de la morfolorgía y composición química de las células y los tejidos, toda muestra biológica debe ser fijada para evitar alteraciones en las estructuras tisulares, de esta manera se evita la autodestrucción celular, la proliferación de microogranismos que se encuentren en la misma muestra o provenientes del entorno, etc. Además el tejido adquiere más resistente y soporta pasos posteriores. El fijador de rutina es el formaldehído, pero existen otros fijadores y mezclas fijadoras que se utilizaran de acuerdo a la muestra a estudiar.
Luego de completada la etapa de fijación con formaldehído, debe extraerse el agua de la muestra fijada mediante un paso que se denomina deshidratación. La muestra se deshidrata mediante sucesivos alcoholes de concentración creciente hasta alcanzar alcohol 100°. Posteriormente el alcohol debe ser extraído mediante un reactivo que sea miscible en parafina y en alcohol por ejemplo con xilol (agente aclarante), este paso se denomina aclaramiento o desalcoholización.
Inclusión:
La inclusión consiste en lograr en el tejido una consistencia que permita realizar cortes muy finos, esto se logra haciendo un bloque de material neutro y consistente por ejemplo, parafina. Para lograr hacer el bloque propiamente dicho, primero a la muestra se le debe realizar dos o tres baños de parafina líquida, en estufa a 60° C, siendo el último baño con la parafina que se va a utilizar para armar el bloque. Posteriormente esta parafina y la muestra se encastra en un molde, y se deja enfriar hasta que adquiera un estado sólido, se talla y posteriormente se corta. El bloque puede armarse también con una máquina de parafina en un casete como muestra las fotografías 1 y 2
Obtención de cortes
Cortes para microscopía óptica
La microtomía es la obtención de cortes lo muy delgados que permitan su posterior visualización con el microscopio.
Para la microscopía óptica el instrumento que nos permite realizar cortes tan delgados de 3-5 micrómetros, se llama micrótomo y posee una cuchilla de acero. (Ver fotografía 3)
¿Por qué los cortes deben ser tan finos?
Para que cuando lo observemos con microscopio óptico solamente haya una capa de células y no se superpongan.
Cortes para microscopía electrónica: ¡Ultrafinos!
Para la microscopía electrónica de transmisión se necesitan realizar cortes ultrafinos de 40-70 nanómetros, y el instrumento que permite lograrlo es el ultramicrótomo. El ultramicrótomo posee una cuchilla de vidrio o de diamante. (Ver fotografía 4 y 5)
A medida que se obtienen los cortes en parafina, se colocan en el baño de flotación y se adhieren a un portaobjetos. El baño de flotación contiene agua, una poca cantidad de polvo de gelatina, una temperatura de 41-42°C favoreciendo la adhesión del corte al portaobjetos. (Ver fotografía 6 y video). ¿Qué otros medios de adherencia conoces o utilizas? ¡Contame en los comentarios!
Técnica de coloración, histoquímica, impregnaciones
La técnica de rutina es la hematoxilina y eosina, en el siguiente enlace se encuentra material sobre esta técnica: ¿Hematoxilina o hemateína?
Dado que los cortes en parafina carecen de color, se necesita realizar una técnica de coloración, histoquímica o de impregnación dependiendo de lo que se necesite evidenciar o estudiar. Para realizar la técnica en primer lugar debe extraerse la parafina, puesto que es hidrófoba y la mayoría de los colorantes se emplean en solución acuosa. Por lo que si la parafina no es extraída, el tejido no se teñirá.
Para deparafinar, es decir, extraer la parafina de los cortes, se colocan los cortes obtenidos en un coplin con xilol en la estufa a 60°C durante 15 minutos). Posteriormente, en el mismo coplin se hidratan los cortes mediante baños de alcohol de concentración decreciente, un baño de agua corriente y uno de agua destilada para poder realizar la tinción. Luego de realizada la tinción, se vuelve a deshidratar, se colocan en xilol y se monta.
Montaje
Generalmente se utiliza como medio de montaje el Bálsamo de Canadá, se coloca el cubreobjeto y se deja unos minutos para secar. (Ver fotografías 8 y 9) donde los preparados ya están montados y prontos para visualizarlos con el microscopio óptico.
Bibliografía:
- GARCIA DEL MORAL, Raimundo. “Laboratorio de Anatomía Patológica” Interamericana-McGraw Hill, 1993
- Geneser, F., Histología. Editorial Médica Panamericana. 3° edición
- Protocolo de clases prácticas de Histología (2017) Ciclo básico clínico comunitario. Facultad de Medicina, Udelar
- Ross, M., (2007), Histología: Texto y atlas color con Biología Molecular Y Celular. Editorial Médica Panamericana
- Rosa, L (2017) Destrezas prácticas de laboratorio y comparación de técnicas histológicas.
- S.PODESTA, I.SANSON, “Introducción a las Técnicas Histopatológicas” Facultad de Medicina